天木生物ARTP與MMC成功助力靈芝菌株的高通量選育

本期為您推薦上海市農業科學院張勁松研究員團隊近期公開的一份發明zl：一種靈芝菌株的高通量選育方法。該研究利用室溫常壓等離子體誘變儀（ARTP），構建大規模誘變庫，結合微液滴培養技術（MMC）進行高通量篩選，篩選到三個靈芝菌株，通過搖瓶傳代5次發現三個靈芝誘變株的遺傳性狀穩定，可應用于靈芝產業中的生產和研究。

靈芝(Ganoderma lucidum)是一種重要的藥用真菌，具有多種藥用功效，如免疫調節、抗腫瘤等。近年來，隨著人們對健康食品和保健品的需求增加，靈芝及其相關產品的市場需求也日益增長。然而，靈芝的生長速度和產量較低，限制了其應用及產業化的發展。目前，常見的靈芝菌株選育方法主要是利用化學誘變法和物理誘變法。化學誘變法會帶來較高的毒性和突變率，可能存在味道不好和生物安全問題。而物理誘變法在保證品質穩定和生物安全的同時，也能產生大量變異體。

近年來，ARTP誘變技術在在生物育種中有著廣泛的應用，該技術具有誘變效率高、操作簡便、突變范圍廣、不影響基因組整體穩定性等優點。MMC技術則是一種高通量微量培養技術，通過使用微小培養箱和液面控制器，將大量菌株同時在微小體積內培養，從而減小了單個菌株生長過程中的擾動，并可同時研究多個菌株在不同環境下的代謝活性。結合使用ARTP和MMC技術，可以實現對微生物菌株的快速、高效的選育，從而提高菌株的產量、適應性和其他優良性狀，為靈芝的高通量篩選提供了技術基礎。

本研究中，研究團隊首先對靈芝菌株G0023活化并制備原生質體，利用ARTP IIS對原生質體進行誘變，計算致死率（圖1）。當致死率達到90％的時候所設置的參數作為后期處理的最佳處理參數。針對誘變后的原生質體，利用MMC系統(微生物液滴培養儀)進一步篩選，選育靈芝G0023誘變菌株。對野生菌株與誘變篩選后的菌株進行平板與搖瓶水平進行比較，分析其生長性能，葡萄糖的利用與三萜的產量，并對誘變菌株進行傳代，驗證其遺傳穩定性。

利用平板的菌落半徑從誘變庫中篩選出3株菌株（表1），搖瓶中發酵并測定誘變菌株對底物葡萄糖利用率，菌絲體干重，菌絲體中三萜產量。結果顯示4個菌株在發酵7天后，培養基中葡萄糖的利用率都處于較高水平（圖2），其中2株菌的菌絲干重較野生型提高26.33％和17.85％。這兩株菌的三萜產量提高了32.10％和15.72％（圖3）。三個菌株搖瓶傳代5次后對其生長情況進行分析發現，各誘變株遺傳穩定性較好（圖4）。這些結果顯示用ARTP誘變技術和MMC高通量篩選技術相結合，可以從靈芝菌株中高效篩選出生長速度快、產物含量豐富的優良菌株。

圖1 靈芝G0023原生質體致死率曲線

表1 三個誘變菌株與G0023在平板生長速度

圖2 G0023與誘變菌株搖瓶發酵情況

圖3 G0023與誘變菌株菌絲體總三萜產量

圖4 三個誘變菌株遺傳穩定性分析